首款siRNA药物Onpattro的制剂学概述（独家原创）

专家介绍

韩军教授，国家第八批“千人计划”特聘药物制剂专家、教授、博导，山东省“泰山学者”特聘专家，第二军医大学药学学士，美国明尼苏达大学药剂学博士，现任抗体药物与靶向治疗国家重点实验室（上海）首席科学家，聊城大学生物制药研究院院长、海藻活性物质国家重点实验室（青岛）学术委员等。韩教授领导建设了山东省抗体制药协同创新中心及山东省纳米药物与释药系统工程技术研究中心，并任中心主任。目前，已经有近6000 万元的实验室及设备投入，致力于把这个平台建设成为国际水平的药物制剂研发和产品开发平台。技术平台包括物理药学、纳米药物、冷冻干燥、热熔挤出、结晶工艺、仿制药质量一致性评价、口崩制剂、缓释制剂、和大分子蛋白制剂等。

韩教授在美国工作生活20 多年，曾就职于Sanofi, Pfizer, Abbott, Novartis,Teva 等国际制药企业。韩教授主持和参与了几百个药物成药性评审、技术改造、及创新制剂项目，并管理开发和报批了上百个仿制药及创新剂型产品到美国和欧州医药管理审批机构。曾先后被美国药学会及世界著名药厂多次嘉奖，包括雅培公司药物研发部(PARD) 授予的创新奖和团队合作奖；美国药学会(AAPS) 授予的制药技术研究奖（EM Industries Sponsor）、药物传递和技术奖（P&GSponsor）等。1994 年起为AAPS 处方前研究委员会成员。曾任位于波士顿的美中生物医药协会（CABA）创会会长和首届董事会主席。

正文

首款siRNA药物

Onpattro的制剂学概述

季爱民（南京制药厂有限公司 ），韩军（聊城大学）

       2018年8月10日，美国FDA （https://www. accessdata.fda.gov/scripts/cder/daf/index.cfm? event=BasicSearch.process/)宣布批准Onpattro（patisiran）输注治疗遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性（hATTR）引起的周围多发性神经疾病（polyneuropathy）成人患者。RNAi疗法的上市，必将掀起一场制药行业的革命，是诺贝尔奖成果从概念走向实际治疗用途的一个光辉里程碑。Onpattro采用脂质纳米粒（Lipid Nanoparticle, LNP）给药系统成功实现了siRNA分子治疗疾病的临床转化。本文就Onpattro的制剂概要、LNP给药系统的设计及制备技术、肝脏及其它组织靶向性、存在的问题及未来前景等进行概述。

● Onpattro（patisiran）制剂概要

由美国Alnylam开发的Onpattro（以前称作patisiran）是一种能特异性沉默hATTR表达的siRNA药物，见下图1，是世界上基于2006年诺贝尔获奖的RNA干扰（RNAi）技术原理研发而批准上市的首款siRNA药物及首个非病毒给药系统的基因治疗药物。Onpattro是一种脂质复合物注射液，将siRNA包裹在脂质纳米颗粒（LNP）中，静脉输注后药物直接递送至肝脏细胞内，沉默hATTR mRNA的表达，减少产生hTTR蛋白，逐渐减少周围神经中淀粉样沉积物（hTTR）的积累，最终达到治疗疾病的目的。Onpattro曾获得美国FDA授予的突破性疗法认定、优先审评资格、快速通道资格和孤儿药资格。Onpattro是一种无菌、无防腐剂、白色至乳白色的均质溶液，单剂量玻璃瓶包装，但瓶塞不是普通胶塞。有两种规格供选择使用：10 mg/5 mL 或2 mg/mL 溶液，静脉输注给药。在2°C - 8°C (36°F - 46°F)条件下储存，室温条件下（小于 25°C）存放14天有效；不要冷冻（freeze）储存；温度不超过30°C时，在输液袋中存放及输注时间不得超过16小时。Onpattro制剂的处方组成见下表1。

● LNP给药系统的设计及制备

Onpattro中的siRNA分子通过RNAi原理介导治疗TTR淀粉样病变。 siRNA分子的分子量约为14kD，带负电荷，具有生物大分子结构特性。体内应用siRNA分子治疗疾病存在稳定性差（易被核酸酶降解）、脱靶效应、易被肝肾清除、免疫原性、难以穿过细胞膜被靶细胞摄取、及难以从细胞内体（Endosome)中逃逸等问题。因此，综合考虑siRNA体内应用需要解决以下问题，1）设计siRNA序列及避免脱靶效应；2）避免血液及细胞内核苷酶的降解及免疫原性；3）给药系统递送siRNA分子进入靶细胞内；4）细胞内含体释放进入胞浆实现RNAi。通过生物信息学可有效设计siRNA序列，避免脱靶效应；通过核酸化学修饰可避免核苷酶降解及免疫原性。通过核酸化学可以有效解决其它问题，但目前制约siRNA分子临床应用的瓶颈问题是给药系统及内含体释放。

      尽管存在以上给药系统的障碍，但以脂质纳米粒（LNP）为给药系统的世界上首款siRNA药物制剂Onpattro，获得FDA批准成功上市。LNP给药系统的设计原理可简单总结如下：

（一）设计原理

LNP系统起源于小分子药物脂质体给药系统的研制。脂质体系统是一类含有脂质双层结构的LNPs，许多膜脂，如磷脂酰胆碱(PC)，当分散在水介质中时会自发地采用双层结构。已证明可用于药物输送的特殊亚类脂质体--大单层囊泡(Luvs)，直径在100 nm范围内，含有一单层的双层物质，将内部水介质与外部介质分离。目前全世界已批准9种脂质体药物制剂用于静脉给药这些系统大多含有小分子抗癌药物，依赖于小分子(直径<100 nm)LNP系统在静脉给药后优先向肿瘤部位渗透。这种优先渗透是因为肿瘤新血管可能含有直径高达200 nm的孔，可致小颗粒系统渗入肿瘤组织。小LNP在肿瘤组织中的优先蓄积被称为“增强穿透和保留”(EPR)效应。EPR效应与具有长循环特点的Luvs相结合，与游离给药相比，肿瘤部位摄取的药物量可提高10倍。避免了游离药物对其它组织的刺激，达到最大的治疗优势效果。

LNP小分子药物递送系统是一种相对成熟的技术，已经形成严格的设计标准，其中许多标准已纳入设计LNP核酸类药物递送系统。这些标准包括纳米粒直接为100 nm或更小、高效囊化（包封）工艺，严格且可放大的制造工艺，且产品稳定性在4℃至少1年。一个关键的特点是相对中性的表外面，可避免血清蛋白广泛吸附在LNP上，导致迅速堆积于循环中固定和游离的巨噬细胞中，减少对靶组织的渗透。利用LNP技术递送核酸类药物（RNA及DNA）需要开发高效包封的方法。由于分子量大小和负电荷及响应跨膜pH梯度，用于将小分子药物装入 LUVs的技术不能应用于带负电荷的大分子。引入与RNA和DNA分子有很强静电结合的阳离子脂提供了一种方法。然而，在最初的实验中，带有恒定正电荷的阳离子脂质材料直接与核酸聚合物混合形成“复合物”，虽然这些“复合物”给药系统已证明在体外转染有效，但由于其体积大(直径大于1mm)、不稳定、表面正电荷和剂量限制的毒副作用，它们在体内的应用受到限制。

（二）LNP制备过程

 在LNP给药系统中引入离子化阳离子脂质，如1,2-二油酸基-3-二甲基丙烷（DODAP），结合乙醇加载技术，获得了基因药物高负载效率、直径<100 nm、及低表面电荷的LNP系统，从而克服了直接混合所得复合体的许多问题。特别是，阳离子脂如DODAP的表观PK（pKa）＜7，在低pH(如pH4)时带正电荷，可有效包封负电荷的核酸，形成LNP。随后，pH可以提高到生理值范围，LNP保持相对中性的外表面。乙醇负载技术的第一种方法是在pH 4条件下，含有DODAP及其它“结构性脂质材料”与含~40%乙醇中的核酸物质混合，制备LNP。随后开发了一种在T型管中混合的方法：先将脂质材料（包括阳离子脂及聚乙二醇脂（PEG脂））溶解于乙醇中，与核酸水溶液（pH4）进行混合，同样可得到直经<100nm的LNP系统。 后来又开发了更快速及可控的微流体（microfluidic）混合技术，得到了质量更好的LNP系统。快速混合制备LNP-寡核苷酸制剂的可视化技术描述如图2所示，可直观理解乙醇负载技术如何制备高包封率的LNP制剂。

最常见乙醇负荷技术制备siRNA/LNP系统的过程为，先配制含离子型阳离子脂、胆固醇、硬脂酰PC（DSPC）和PEG脂质（摩尔比40-50/40-30/10/10-1）的乙醇溶液，与含siRNA的水溶液（pH4）迅速混合，其中氨基脂与含磷酸核苷酸的比例（N/P)为6，水溶液与乙醇的体积比为3：1。混合后，LNP分散体在pH4的缓冲液中透析去除微量乙醇，提高缓冲液的pH至生理值范围（pH7.4）继续透析。乙醇负载快速混合制备的LNP系统，制备过程快速、重复性好、可放大及包封率接近100%，可通过调节PEG含量选择制备不同粒径的LNP。得到的LNP稳定性好、粒子表面呈低电荷，有利于体内使用。分子模型鉴定的siRNA/LNP系统中，囊化核酸的脂质形成翻转胶束后组成疏水性中央区，外面包裹PEG脂质。低温透射电镜下发现该结构由“固态”核心支撑，类似于“葡萄干样圆面包”（currant bun ）形态结构中含有带负电荷的金色纳米粒。目前，还没有测定到LNP囊化mRNA及DNA的结构。

（三）siRNA/LNP给药系统的肝脏靶向性

首次发现siRNA在体内肝脏具有基因沉默活性的研究就是用含离子型阳离子脂质的LNP囊化siRNA分子经i.v.给药后实现的。该研究使用离子型阳离子脂1，2-二羟基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDMA，一种含有亚油酸酰基链的DODAP醚类似物)制备LNP，并且发现LNP的功能活性与所用阳离子脂种类特别相关，这引起广泛合成多种脂类物质的研究，通过鉴定及优化囊化siRNA分子后LNP在生物体内的活性，得到了一种名称为二油甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA，通常缩写为MC3)的脂，现在成为制备肝脏靶向siRNA/LNP系统用脂类材料的“金标准”。与用DLinDMA相比，用MC3制备siRNA/LNP给药系统后，肝脏组织细胞内的基因沉默活性显著提高三个数量级，而阳离子脂结构的变化对活性的影响相对较小。决定阳离子脂质效价的主要因素是酰基链的不饱和度、醚键的引入、特备是阳离子脂质中氨基功能团的pKa值，用pKa值在6.2-6.4之间的脂质材料制备得到的siRNA/LNP显示在肝脏中的基因沉默效率最高。

      在优化合成离子化阳离子脂质的过程中，同时考虑了非双层脂质结构在细胞内促进siRNA等大分子传递及释放等方面的潜在作用。40年前，人们发现膜脂物质(如不饱和磷脂酰乙醇胺，PES)采用非双层结构，如在水溶液中形成六边型HII相（hexagonal HII phase）等现象，从而提出膜融合是通过非层状中间产物进行的。大约20年后，使用永久带正电的阳离子脂质作为转染试剂，在分散体中诱导阴离子形成HII相，可致外源性的阳离子脂与细胞内源性的阴离子结合形成非完整性的单层膜结构，最后将阳离子脂携带的核酸物质释放进细胞内。大量证据表明，含离子型阳离子脂的LNP/siRNA系统在体内通过细胞内吞方式堆积于肝脏细胞内。必须用足够高 pKa值的离子型脂质制备LNP，一旦进入内含体可满足提供大量质子泵（阳离子）需求，以便结合胞浆内内源性的阴离子来破坏内含体的双层膜结构，释放荷载的siRNA；但也不能太高，因为低pKa值的LNP表面带电荷，不容易在到达靶细胞前被体内免疫系统清除。需要多聚不饱和酰基链帮助去稳定内含体双层脂质膜，以便更多的核酸逃逸出内含体进入胞浆内。

非双层假说为提高阳离子脂质效价的研究提供了有力的理论基础，但这些LNPsiRNA系统对肝细胞的相对特异性提示了一种靶向机制。在此，使用体内基因沉默模型进行LNP优化的好处变得明显，并发现含有离子型阳离子脂质的LNP系统具有难以预先预测的“自然”靶向过程。具体来说，这些系统对载脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)的吸附能力对肝脏细胞内基因沉默效率至关重要。可在野生型小鼠肝细胞内实现基因沉默的LNP siRNA系统，在ApoE基因敲除小鼠体内肝脏中很少或根本没有基因沉默效果。然而，与ApoE预孵育可恢复在肝脏细胞内的基因沉默效力。这些结果表明，含有离子型阳离子脂质的LNPsiRNA系统就像乳糜粒脂蛋白（chylomicrons）一样，通过吸附内源性的ApoE，从而触发肝细胞表面的ApoE受体摄取，达到进入肝脏细胞内的目的。

阳离子脂以外的LNP组分的存在和相对数量也决定了LNP siRNA系统介导的基因沉默效率。例如，虽然可以在N/P值低至1的情况下实现相对完整的siRNA包封，但得到的系统并不能产生有效的基因沉默效果。优化后的LNP系统使N/P值在6左右时，表明需要非siRNA相关的阳离子脂质来实现体内逃逸。此外，所用PEG-脂质的类型和数量决定了纳米粒的大小，并强烈影响LNP siRNA系统的基因沉默能力，这可能是降低了纳米粒与细胞的相互作用及（或）吸附ApoE能力等有关。使用一种含有短(C14)酰基链的聚乙二醇脂质(C14)制备得到的LNP，体内的半衰期<30 min，可获得最佳的肝细胞基因沉默效果。

结合经过优化的阳离子脂MC3、胆固醇和DSPC，再加上快速解离的PEGC14脂质，制备得到的LNP系统，可以在0.005 mg siRNA/kg体重的剂量水平下使小鼠肝细胞中的任何基因沉默。在临床前模型中观察到MC3的高效价和优良的耐受性，美国 Alnylam公司利用其制备了LNP siRNA药物 Onpattro。

● LNP 给药系统的应用范围

LNP siRNA给药系统靶向肝外组织 LNP siRNA药物在肝细胞中有许多潜在的临床应用价值，但ApoE介导的脂蛋白颗粒的摄取也可发生在脑等其它组织中。由于存在血脑屏障，低密度脂蛋白(LDL)中的胆固醇不能到达大脑。因此，大脑合成自己的胆固醇，并利用载脂蛋白(ApoE)将胆固醇转运到神经元，通过ApoE介导的内吞作用(类似于肝细胞)进行摄取。已经证明，在肝细胞中具有基因沉默有效性的LNP siRNA系统，经大脑皮层内给药后在神经元中具有相同的基因沉默有效性；脑室内及脑鞘内给予LNP siRNA系统，全脑内显现基因沉默功效，具有治疗严重神经退行性疾病的应用前景。

      静脉注射LNP siRNA系统后具有基因沉默的其他组织细胞包括巨噬细胞、破骨细胞、“硬”骨中的成骨细胞、及远端肿瘤细胞。由于EPR效应，大量存在于循环系统中的LNP系统能自然靶向免疫细胞。然而，巨噬细胞、破骨细胞、成骨细胞和远端肿瘤细胞中产生显著基因沉默所需的siRNA剂量水平至少比在肝细胞中产生基因沉默所需的剂量高出两个数量级，导致治疗指数低，不值得临床开发。在此，在确定有效治疗剂量之前，需要显著提高LNP siRNA的载药效力。

● LNP mRNA和质粒DNA给药系统 

研究表明， 乙醇负载LNP siRNA系统制剂制备技术及设施同样适用于制备生产LNP mRNA和LNP质粒（pDNA）系统。有趣的是，需要优化离子型阳离子脂（如MC3），才能使siRNA在肝细胞中获得最佳基因沉默活性，但对于mRNA或质粒DNA的表达则不需要优化。这可能是LNP给药系统肝脏靶向是 ApoE依赖的，两种情况（但荷载不同药物）下具有相同的组织亲和性。因此，LNP(MC3) mRNA系统经i.v.给药后，显示了较高的肝脏内基因表达水平，经优化后的阳离子脂负载最大量的mRNA给药后，肝脏中的表达水平可提高20倍 (https://acuitastx.com)。如在非人灵长类动物体内给予0.03mg mRNA/kg体重的剂量，所表达的促红素足以达到治疗必须的生理浓度。这些研究表明，肝脏可以作为需要替换蛋白的生产工厂，或可生产治疗用蛋白，如单克隆抗体，靶向治疗肿瘤或其它部位疾病。

以这种方式使肝脏作为生物反应器为多种疾病治疗开辟了新的途径。例如，在接触埃博拉或狂犬病等可能致命的病毒感染后，使肝脏瞬间迅速分泌中和抗体可提供一种新的方法来诱导快速“被动”免疫。同样令人印象深刻的是LNP mRNA系统在“主动”免疫方面的潜在应用。皮下、肌肉或皮内注射含有编码多种传染病相关蛋白抗原mRNA的 LNP系统，导致啮齿类动物和非人灵长类动物完全免受寨卡病毒感染的疾病的影响，在临床前模型中产生了令人印象深刻的免疫应答。

      由于LNP给药系统平台能使mRNA在体内表达蛋白，特别是在肝脏，这为新兴出现的基因编辑（ gene editing）技术在体内的应用，提供了令人遐想的应用前景。目前，各种基因编辑技术都依赖于病毒载体，递送位点特异性的靶向核苷酶进入细胞。病毒载体的主要缺陷是重复给药后体内产生中和抗体，但体内使用LNP siRNA给药系统目前还没有发现产生中和抗体。在疫苗领域，相信很快会发表相应的论文。给予LNPs DNA也显示了体内活性。利用乙醇负载法，结合离子型阳离子脂制备LNP，不仅能有效包封长达7kb的DNA质粒，且能高效转染培养的原代细胞或分裂细胞。将LNPs DNA注射进发育中鸡胚，局部组织中可高水平表达标记蛋白，没有发现明显的毒副反应，显示了良好的疾病治疗前景。

● LNP核酸药物制剂存在的问题和解决方案

LNP系统显然显示了临床基因治疗的应用前景。然而，仍存在的主要问题，1）LNP RNA，或DNA制剂体内应用时机体对其中聚合物产生的免疫应答反应；2）需要进一步提高LNP的功能，以便在除肝脏外的其它组织中发挥siRNA、mRNA、及DNA的治疗价值。在这里，LNP技术固有的灵活性脱颖而出。 例如，对含有RNA和DNA基因药物的LNP制剂产生免疫反应的主要原因是体内存在多种模式识别受体，这些受体可以感应到非自体核酸，构成了保护细胞免受感染的复杂的天然安全机制。可以通过核酸化学方法修饰核酸减少这种免疫反应。然而，很难完全消除产生显著免疫反应的潜力，特别是在易感个体中。因此，临床使用LNP siRNA时，常常协同给予诸如地塞米松等免疫抑制剂，如临床使用Onpattro时，同时使用了地塞米松，这使LNP基因药物的研发变得复杂化。然而，目前还得利用LNP作为核酸药物递送系统的优势。例如，最近的研究表明，将尽量少的疏水性地塞米松前药（4 mol%相对于总脂)包含在LNP系统中，基本上可以消除包封的寡核苷酸中CpG序列产生的免疫应答反应。

类似的方法可被用于提高除肝脏外其它组织内LNP系统发挥核酸药物的效力。另外，LNP给药系统还需要仅因不的优化，因为实际上仅有<5%的内吞LNP siRNA被释放到细胞胞浆中，40-60%被循环外排到细胞外基质中，大部分剩余的内吞LNP siRNA进入其它非功能性亚细胞器，如溶酶体内发生降解。因此，抑制细胞内多种蛋白质协同驱使的内含体循环或进入内含体内，可潜在增加siRNA 或其它核酸药物从内含体内逃脱进入胞浆内的机会，以便发挥更大的生理功能。

● 未来展望

继第一代小分子药物、第二代蛋白类生物药之后，第三代“智能”纳米药物将最大限度地利用生物体内过程，实现体内应用的高度靶向性，降低对人体的毒副作用。显然，含有核酸药物的LNP系统将在这一进化中扮演重要角色。一个显著的新特征是开发了能够囊化带负电荷的大分子siRNA（平均分子量为MW 13 kD）的LNP给药系统。LNP给药系统在体内能递送更大分子量的mRNA 及质粒DNA发挥生理功能，可能允许治疗许多突变基因引起疾病所需的精确基因疗法付诸实施。

值得注意的是，通过利用“自然”靶向过程，如靶向肝细胞的ApoE依赖的内吞途径、或纳米粒子对免疫细胞的天然靶向，而不是利用配体靶向，促进了第三代智能药物的开发。此外，除了有效负载核酸药物外，LNP系统可包含多种可修饰的组分，类似提供了一个相当大的工具箱，可最大程度地发挥负载药物的效力及降低药物的毒副作用。

采用LNP给药系统使得Onpattro成功上市，必将在全世界范围内推动 siRNA药物给药系统及siRNA药物开发的研究热潮。